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电转EHA105 感受态细胞	AE1010S	10×50ul
	AE1010M	50×50ul

基因型

C58 (rif^R) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine

产品说明

EHA105菌株由EHA101菌株改造而来，为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。EHA105菌株适用于水稻、烟草等植物的转基因操作，唯地生物开发的EHA105电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒（12739bp，Kan^R）检测转化效率>10⁵ cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒（40kb，Kan^R）检测转化效率>5×10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，感受态转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天

（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，10 μg/ml rif 时，需28℃培养48-60 h；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60-72 h；EHA105平板或液体培养时均不建议使用大于20 μg/ml的利福平浓度。

5. 液体摇菌：农杆菌是好氧菌，固体平板上菌落的生长和液体摇菌均需要大量氧气，液体摇菌成功的关键是保证营养液中溶解足够的氧气：1，要用透气试管或三角瓶；2，保证营养液有大的横截面和小的厚度；3，抗生素尽量少加或不加，必须添加的抗生素尽量使用低浓度，不使用高浓度。(唯地生物推荐的小摇方法：12-15ml 的圆底透气试管中加入1ml 含有抗生素的LB，新鲜的农杆菌平板中取1-2个单菌落接种，30度、200rpm 摇菌24-48h；大摇方法：100ml透气三角瓶中加入不超过20ml含有抗生素的LB，取小摇菌液按2%比例接菌，30度、200rpm 摇菌24-48h。

关于农杆菌的利福平抗性：

      农杆菌的利福平抗性来源于农杆菌的一个核基因突变，不在Ti质粒上，所以利福平与Ti质粒是否丢失没有关系，利福平并不是农杆菌培养过程中必须要添加的抗生素；相反，在农杆菌培养基中加入利福平特别是加入利福平浓度过高会导致农杆菌生长变慢，侵染活力降低，不建议在农杆菌的培养基中加入利福平，在没有超净台的实验室加入利福平可以抑制杂菌生长，在超净台中进行农杆菌实验可不添加利福平（1-4）。

      不同农杆菌来源不同，有不同的核基因和Ti质粒，表现出不同的生长势，特别是在含有抗生素的培养基中生长时，表现出对抗生素不同的敏感度。EHA105对利福平更加敏感，生长更容易被利福平抑制，对利福平浓度的高敏感性也是EHA105菌株的一个鉴定标准。图1显示含有pCambia2301质粒的EHA105、LBA4404在LK50，LK50+Rif20，LK50+Rif50三种培养基中的生长曲线——利福平对EHA105菌株影响较大，在液体培养基LK50中添加利福平不仅影响EHA105的生长速度，同时也影响EHA105的终浓度（在LK50中添加20ug/ml的利福平可以将EHA105的生长时间延迟7h，终浓度从OD600=6.42降到5.22，在LK50中添加50ug/ml的利福平可以将EHA105的生长时间延迟11h，终浓度从OD600=6.42降到4.13；而对照菌株LBA4404对液体培养基中利福平的浓度变化并不敏感，只是终浓度略有下降）。

图1：含有pCambia2301质粒的EHA105、LBA4404在LK50，LK50+Rif20，LK50+Rif50三种培养基中的生长曲线

生长曲线制作方法：将pCambia2301质粒分别转化EHA105、LBA4404菌株，涂板到LK50平板，48h长出的菌落接种到1ml LK50液体培养基中(试验中均使用12.5ml圆底透气试管摇菌)，30℃，200rpm摇菌24h，按2%的比例分别接种到1ml LK50，LK50+Rif20，LK50+Rif50三种培养基中，测OD600值。LK50: LB+Kan 50ug/ml；LK50+Rif20: LB+Kan 50ug/ml+Rif 20ug/ml；LK50+Rif50: LB+Kan 50ug/ml+Rif 20ug/ml。

注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司EHA105感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。

References

1. Suma, B., Keshavachandran, R., & Nybe, E.V. (2008). Journal of Tropical Agriculture, 46,38–44.  

2. Hood, E.E., Gelvin, S.B., Melchers, L.S and Hoekema, A.1993. Transgenic Res., 2: 208–218.

3. Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) . Biotechnology (N Y) 9: 963–967.

4. Garfinkel DJ, Simpson RB, Ream LW, White FF, Gordon MP, Nester EW (1981). Cell 27: 143–153.

备注

1、农杆菌相关抗生素配方：

2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB（唯地CAT#：CM1010）及YEB（唯地CAT#：CM2010）配方：