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∆cot1 ∆zrc1 感受态细胞	YC1275S	10×100ul
	YC1275M	50×100ul

基因型

MATa his3Δ1 leu2 met15Δ ura3-52 ∆cot1 ∆zrc1

产品说明

∆cot1 ∆zrc1菌株来源于BY4741，为配子MATa型，主要用于锌离子转运蛋白的研究中。COT1（YOR316C），属于CDF（Cation Diffusion Facilitator）金属转运蛋白家族；定位液泡膜，介导二价金属离子向液泡内隔离储存（H⁺/ 金属反向转运）。Cot1p 蛋白，439 aa，约 48 kDa，多次跨膜蛋白；功能：将胞质内 Co²⁺、Zn²⁺转运进液泡封存，降低胞质游离重金属浓度，实现解毒；ZRC1（Zinc Resistance Conferring）编码液泡膜锌转运蛋白，将锌从细胞质输送到液泡中贮存，对锌突然涌入细胞质引起的锌休克也有抵抗作用。∆cot1 ∆zrc1菌株中的cot1，zrc1基因被完全敲除，锌离子转运能力降低，在SD/-Ura基础培养基上可以正常生长，在含有高浓度Zn2+的SD/-Ura培养基上几乎不生长，是发现和研究锌离子转运蛋白的高效试验平台。∆zrc1酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、尿嘧啶缺陷型菌株。可直接通过PEG/LiAc将pYES2、pDR195、pDR196等质粒转化进入∆cot1 ∆zrc1细胞内，筛选标志为URA，可用SD/-URA平板进行筛选。唯地生物生产的∆cot1 ∆zrc1感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒（5857bp，Amp^R）检测转化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴3 min，加热后快速插入冰中。

2. 取100 µl冰上融化的∆cot1 ∆zrc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.1-2 µg（质粒体积不超过感受态体积的10%），预处理后的Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。

3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。

4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH₂O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。

5. ddH₂O 50 µl重悬，涂板（筛选平板可根据转化质粒的筛选标记选择SD缺陷型平板），29℃培养48-96 h。

锌离子转运试验示例/唯地生物验证试验

     空载体pDR196为阴性对照（唯地货号：PS2011）； pDR196-AtMTP11(表达拟南芥MTP1基因，唯地货号：PSP1271)为阳性对照；这两个质粒分别转化∆cot1 ∆zrc1 酵母细胞，点板做表型分析。结果如下图所示：∆cot1 Δzrc1（pDR196-AtMTP1）和∆cot1 Δzrc1（pDR196）均可在SD/-Ura培养基（唯地货号：YM3104S）上正常生长；但在含1 mM Zn2+培养基中∆zrc1 ∆cot1（pDR196）几乎不生长，而∆zrc1 ∆cot1（pDR196-AtMTP1）的生长状态基本无变化，说明AtMTP1具有锌离子转运活性。

图1 AtMTP11锰离子转运活性检测（本公司验证结果）

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

2. 酵母为真核生物，感受态不能长期保存，建议保存时间不超过90天。

3. ∆cot1 ∆zrc1酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

4. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。