质粒图谱与基础信息

质粒简介

pDHB1 是分裂-泛素膜酵母双杂交（NMY51膜系统）系统的诱饵（bait）载体，专门用于膜蛋白 / 膜相关蛋白互作筛选，不是普通核酵母双杂交载体。 全长：8949bp；配套酵母菌株 NMY51。

pDHB1 融合模式：Ost4信号肽-【诱饵Bait】-Cub-LexA-VP16。Ost4 信号肽把整个融合蛋白定位到内质网膜；Ost4 信号肽进入 ER 内腔；诱饵蛋白的 C 端直接接 Cub-LexA-VP16，此片段必须暴露在细胞质侧，系统才能够工作；C 端如果在内质网腔 / 胞外，Cub 被隔离，酵母的泛素蛋白酶无法识别切割，报告基因完全不会激活，实验直接失败。

推荐用 pDHB1 的 Bait 蛋白类型：一，I 型跨膜蛋白（N 端位于 ER 内腔 / 胞外，C-端在细胞质）；二，多跨膜膜蛋白，蛋白的 C-末端定位于细胞质；三，分泌蛋白 / 效应蛋白（蛋白 N 端信号肽进入 ER 内腔，成熟蛋白主体位于胞质侧或主体位于 ER 腔，但C 端伸到胞质）；四，无跨膜、可溶性胞质蛋白（注意：可溶性蛋白优先优先考虑 pBT3STE；只有你希望把可溶性蛋白人为锚定到 ER 膜上做互作，才选 pDHB1）；五，蛋白本身有 N 端信号肽，且 C 端在胞质，需要将蛋白本身的信号肽去除后连接如pDHB1质粒。

不推荐使用 pDHB1 的 bait 蛋白：一，诱饵 C-末端位于 ER 内腔 / 胞外（致命拓扑错误）；二，典型Type-II 型跨膜蛋白：N 端胞质，C 端内腔 / 胞外。优先选 pBT3-N，不能用 pDHB1；三，C-端在线粒体、过氧化物酶体、叶绿体等细胞器内腔的蛋白；四，需要 N 端自由、N 端做互作界面的膜蛋白（若蛋白互作依赖 N 端结构域，N 端被隔离内腔，互作无法发生，这种情况改用 pBT3-N）；五，核蛋白（可溶，不需要膜锚定），核蛋白直接用普通 GAL4 核酵母双杂交（pGBKT7），分裂泛素膜体系不适合。

产品说明

1，本公司质粒均为质粒大提试剂盒提取质粒，因不同质粒的复制子不同，质粒浓度有差异，收到质粒后可直接酶切用于构建载体。

2，随质粒同时提供一管含有质粒的DH5α-m甘油菌种，收到菌种后可直接放-80度长期保存，也可用交叉划线法划线后挑单菌落接菌，大量扩繁质粒。DH5α-m菌株兼顾DH5α和DH10B菌株的优点，在DH5α基因组中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突变使得DH5α-m菌株中保存的质粒更稳定，有利于质粒大量扩繁。

3，质粒序列可在产品页面下载snapgene文件或text文件。

菌株交叉划线法

1，客户收到菌株后，不可直接吸取菌液接种扩繁。应先对菌种进行复壮，待长出单菌落后挑单菌落接菌扩繁；复壮方法如下：在超净台打开盖子，用接种环沾取少量甘油菌液采用交叉划线法（图1）在含相应抗生素的LB平板表面轻轻划线(注意：不要刺破培养基)，将平板封口后放培养箱培养15-20h，即可长出单菌落。

2，交叉划线法：划线的目的是经过几次不连续划线达到梯度稀释菌液的效果，保证能长出单菌落。具体步骤如下：

A，-80度取出的甘油菌应在超净台打开盖子，立即在表面挑取菌液/菌块划线，不用等融化后划线，固体状态时即可用接种环挑取划线，操作要点是“快速操作，立即划线”，目的是最大限度减少温度波动对菌种造成的“冷休克”和冰晶物理损伤；如果收到的是液体甘油菌，可直接划线，在超净台打开盖子用接种环沾取少量甘油菌液划线。

B，用金属接种环灼烧待冷却后划线，注意不要污染，图1所示为标准的五段交叉划线法，分五个区，每个区划三条直线，第1、2区可共用一个接种环，划好1，2区后换一个新接种环划第3区，再换一个新接种环划第4区，再换一个新接种环划第5区，每一次换接种环划线要经过前面划线区的划线痕迹，这样就相当于对菌种进行稀释。简易划线也可只划3个区或4个区。

图1. 五段交叉划线法示意图

注意事项

1，收到含有质粒的菌株应立即放-80度，不可放-20度保存；在4度或室温长时间存放会增加发生错误突变的概率。

2，质粒在不同实验室保存的过程中有发生突变的概率，所以实际的测序结果与数据库下载序列可能会有部分序列存在SNP或突变，只要不在核心元件发生突变或不影响质粒核心功能，一般不影响使用。