表达感受态细胞
产品规格 （CAT#: EC3001）
Lemo21(DE3)： 100μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
| Lemo21(DE3) 感受态细胞 | EC3001S |
10×100ul |
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| EC3001M | 50×100ul |
基因型
fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ∆hsdS / pLemo(CamR)
产品说明
Lemo21(DE3)菌株适用于毒性蛋白，膜蛋白，及其他容易形成包涵体的蛋白的原核表达；缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，减少对重组蛋白的降解；fhuA2突变赋予Lemo21(DE3)菌株对噬菌体T1的抗性。 大肠杆菌中的膜蛋白表达和输出都受到 Sec 转位酶转运能力的限制，如果T7 RNA聚合酶的活力过高，超过Sec 转位酶的转运能力，会导致蛋白毒性产生或包涵体的形成，pLemo质粒（ 具有氯霉素抗性）含有一个鼠李糖诱导的T7溶菌酶表达框 ，可以高效表达T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的抑制剂，可抑制T7 RNA聚合酶的转录活性，降低目标蛋白的合成速度，减少包涵体的形成，提高毒性蛋白，膜蛋白，及其他容易形成包涵体的蛋白的原核表达成功率。Lemo21(DE3)可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Lemo21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Lemo21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上， 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养（Lemo21(DE3)菌株携带 pLemo质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应同时含有34 µg/ml氯霉素，以防质粒丢失）。
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB（唯地CAT#：CM1018L）、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。以质粒pet32a为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度约为LB的3-5倍，SOB的2-3倍。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。
3. 鼠李糖浓度的确定：对一些难表达的蛋白需要做鼠李糖的梯度试验，在大摇接菌的同时加入不同浓度的鼠李糖（0、100、250、500、750、1000、 2000 µM）。此步骤非必须，对容易表达的蛋白可不添加鼠李糖。
4. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
5. 37℃，150-200 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。
6. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
7. 第五步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为0.4mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。
8. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。
9. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
10. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）：
2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 诱导蛋白时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可），最佳的鼠李糖浓度，诱导时间，温度，IPTG浓度需优化。
3.对毒性大的蛋白，在转化感受态涂平板这一步应加入1000 µM的鼠李糖，以促进阳性菌落的形成，并且后面的所有步骤都应该在培养基中加入鼠李糖。
4. Lemo21(DE3)菌株携带 pLemo质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有34 µg/ml氯霉素，以防质粒丢失。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
| Lemo21(DE3) 感受态细胞 | EC3001S |
10×100ul |
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| EC3001M | 50×100ul |
基因型
fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ∆hsdS / pLemo(CamR)
产品说明
Lemo21(DE3)菌株适用于毒性蛋白，膜蛋白，及其他容易形成包涵体的蛋白的原核表达；缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，减少对重组蛋白的降解；fhuA2突变赋予Lemo21(DE3)菌株对噬菌体T1的抗性。 大肠杆菌中的膜蛋白表达和输出都受到 Sec 转位酶转运能力的限制，如果T7 RNA聚合酶的活力过高，超过Sec 转位酶的转运能力，会导致蛋白毒性产生或包涵体的形成，pLemo质粒（ 具有氯霉素抗性）含有一个鼠李糖诱导的T7溶菌酶表达框 ，可以高效表达T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的抑制剂，可抑制T7 RNA聚合酶的转录活性，降低目标蛋白的合成速度，减少包涵体的形成，提高毒性蛋白，膜蛋白，及其他容易形成包涵体的蛋白的原核表达成功率。Lemo21(DE3)可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Lemo21(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Lemo21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上， 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养（Lemo21(DE3)菌株携带 pLemo质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应同时含有34 µg/ml氯霉素，以防质粒丢失）。
蛋白小量诱导表达Protocol (for reference only)
1. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备1-3ml 含相应抗生素的液体LB（或2YT、TB（唯地CAT#：CM1018L）、SB等营养丰富培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。以质粒pet32a为例：在TB营养液中过夜培养的菌体浓度约为LB的3-5倍，SOB的2-3倍。
2. 37℃，200 rpm过夜摇菌约10-15h。
3. 鼠李糖浓度的确定：对一些难表达的蛋白需要做鼠李糖的梯度试验，在大摇接菌的同时加入不同浓度的鼠李糖（0、100、250、500、750、1000、 2000 µM）。此步骤非必须，对容易表达的蛋白可不添加鼠李糖。
4. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按1-2%比例接菌到50ml 含相应抗生素的LB（或2YT、TB、SB等营养丰富培养基），为增加溶氧，最好使用500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的1/10，最高不超过1/5）。
5. 37℃，150-200 rpm摇菌到OD600值为0.5-0.8（一般需要2-4h）。
6. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂IPTG前可取样1ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
7. 第五步的三角瓶中加入IPTG至终浓度为0.4mM（IPTG浓度可自由调整），继续37℃，120 rpm摇菌2-4h。
8. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第2h，4h，6h，8h，14h取样，离心后放-20℃保存）。
9. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中10 分钟， 4℃，5000g，10分钟离心，弃上清，沉淀保存在-20℃。
10. 待所有样品准备妥当，可以做SDS-PAGE分析蛋白表达。
1 M IPTG溶液配制（唯地CAT#：YC8022）：
2.38 g IPTG加入无菌的双蒸水10 mL，完全溶解后用0.22um的滤膜过滤除菌。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
2. 诱导蛋白时，IPTG浓度可选（0.1-2 mM均可），最佳的鼠李糖浓度，诱导时间，温度，IPTG浓度需优化。
3.对毒性大的蛋白，在转化感受态涂平板这一步应加入1000 µM的鼠李糖，以促进阳性菌落的形成，并且后面的所有步骤都应该在培养基中加入鼠李糖。
4. Lemo21(DE3)菌株携带 pLemo质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含有34 µg/ml氯霉素，以防质粒丢失。
