根癌农杆菌感受态细胞
产品规格 （CAT#: AE1040）
EHA101 Elec： 50μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转EHA101 感受态细胞 |
AE1040S |
10×50ul |
|
| AE1040M | 50×50ul |
基因型
C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline
产品说明
EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：kan，赋予EHA101菌株卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，唯地生物开发的EHA101电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pK7WGF2质粒（11876bp，壮观霉素抗性SpecR）检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pK7WGF2-ZH质粒（40 kb，壮观霉素抗性SpecR）检测转化效率>5×103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，感受态转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天
（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90小时）。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml spec，若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低。
备注
1、农杆菌相关抗生素配方：
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
|
硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
|
壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
75 μg/ml |
|
链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
|
庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素 (carb) |
链霉素 (strep) |
利福平 (rif) |
庆大霉素 (gent) |
硫酸卡那霉素 (kan) |
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AGL-1 |
R |
S |
R |
S |
S |
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EHA101 |
S |
S |
R |
S |
R |
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EHA105 |
S |
S |
R |
S |
S |
|
LBA4404 |
S |
R |
R |
S |
S |
|
GV3101 |
S |
S |
R |
R |
S |
3、LB（唯地CAT#：CM1010）及YEB（唯地CAT#：CM2010）配方：
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Component |
LB(液体)/L |
LB(固体)/L |
component |
YEB(液体)/L |
YEB(固体)/L |
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Tryptone |
10 g |
10 g |
Tryptone |
5 g |
5 g |
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Yeast extract |
5 g |
5 g |
Yeast extract |
1 g |
1 g |
|
NaCl |
10 g |
10 g |
牛肉浸膏 |
5 g |
5 g |
|
NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
蔗糖 |
5 g |
5 g |
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Agar |
－ |
15 g |
MgSO4*7H2O |
0.49 g |
0.49 g |
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|
|
NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
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Agar |
－ |
15 g |
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转EHA101 感受态细胞 |
AE1040S |
10×50ul |
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| AE1040M | 50×50ul |
基因型
C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline
产品说明
EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签：kan，赋予EHA101菌株卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，唯地生物开发的EHA101电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pK7WGF2质粒（11876bp，壮观霉素抗性SpecR）检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pK7WGF2-ZH质粒（40 kb，壮观霉素抗性SpecR）检测转化效率>5×103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，感受态转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天
（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90小时）。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml spec，若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低。
备注
1、农杆菌相关抗生素配方：
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抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb)(唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan)(唯地CAT#YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec)(唯地CAT#：YC9070) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
75 μg/ml |
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链霉素(strep)(唯地CAT#：YC9060) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif)(唯地CAT#：YC9080) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent)(唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam）(唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素 (carb) |
链霉素 (strep) |
利福平 (rif) |
庆大霉素 (gent) |
硫酸卡那霉素 (kan) |
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AGL-1 |
R |
S |
R |
S |
S |
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EHA101 |
S |
S |
R |
S |
R |
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EHA105 |
S |
S |
R |
S |
S |
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LBA4404 |
S |
R |
R |
S |
S |
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GV3101 |
S |
S |
R |
R |
S |
3、LB（唯地CAT#：CM1010）及YEB（唯地CAT#：CM2010）配方：
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Component |
LB(液体)/L |
LB(固体)/L |
component |
YEB(液体)/L |
YEB(固体)/L |
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Tryptone |
10 g |
10 g |
Tryptone |
5 g |
5 g |
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Yeast extract |
5 g |
5 g |
Yeast extract |
1 g |
1 g |
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NaCl |
10 g |
10 g |
牛肉浸膏 |
5 g |
5 g |
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NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
蔗糖 |
5 g |
5 g |
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Agar |
－ |
15 g |
MgSO4*7H2O |
0.49 g |
0.49 g |
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NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
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Agar |
－ |
15 g |
