克隆感受态细胞
产品规格（CAT#: DE2040）
ClearColi K12 Electro Cell 50μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
恢复培养基 50ml/瓶
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转K12 感受态细胞 |
DE2040S |
5×50ul |
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| DE2040M | 20×50ul |
基因型
F–λ–∆endA–∆recA–frr181 msbA52 ∆gutQ ∆kdsD ∆lpxL ∆lpxM ∆pagP ∆lpxP ∆eptA
产品说明
ClearColi K12电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。ClearColi K12菌株来源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突变，导致ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰:LPS的低聚糖链被删除，同时LPS的两个酰基链也被删除，进而破坏了ClearColi K12大肠杆菌的内毒素信号通路，使得从该细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低，提取的无内毒素质粒广泛应用于哺乳动物细胞转化。ClearColi K12同时缺失核酸内切酶 (endA)和重组酶 (recA)，提高了质粒DNA的产量和质量。唯地生物开发的ClearColi K12电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×107 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量LB放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml LB）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的ClearColi K12电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的LB（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加LB培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 LB（务必使用高盐培养基平板，不可用 2YT，SOB，SOC 等低盐培养基）平板上。因菌量较大，若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个，将平板倒置 放于 37℃培养箱中培养 36-48 小时（培养 24 小时后可看到很小的克隆）
LB培养基（唯地CAT#：CM1010L）配方(PH:7.0):
Yeast Extract 5g
NaCl 10g
Tryptone 10g
注意事项
1. 因ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰，细胞易死亡，不易保存，平板菌在4度存放时间应不超过1周。且适合在高盐培养基中生长。
2. ClearColi K12电击感受态效率很低，不适用于构建质粒使用，一般用来扩繁质粒，提取高质量的无内毒素的质粒；若构建质粒，请选用DH5a、TOP10等转化效率较高的感受态细胞。
3. ClearColi K12菌株生长缓慢，平板在37度培养时间在36-48小时之间。
4. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
5. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
6. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
7. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
8. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
9. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
10. ClearColi K12菌株的细胞壁被修饰过，细胞比较脆弱，混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少用于涂板的菌量。
11. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
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电转K12 感受态细胞 |
DE2040S |
5×50ul |
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| DE2040M | 20×50ul |
基因型
F–λ–∆endA–∆recA–frr181 msbA52 ∆gutQ ∆kdsD ∆lpxL ∆lpxM ∆pagP ∆lpxP ∆eptA
产品说明
ClearColi K12电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。ClearColi K12菌株来源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突变，导致ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰:LPS的低聚糖链被删除，同时LPS的两个酰基链也被删除，进而破坏了ClearColi K12大肠杆菌的内毒素信号通路，使得从该细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低，提取的无内毒素质粒广泛应用于哺乳动物细胞转化。ClearColi K12同时缺失核酸内切酶 (endA)和重组酶 (recA)，提高了质粒DNA的产量和质量。唯地生物开发的ClearColi K12电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>1×107 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量LB放37度预热1-2小时（每管感受态准备10ml LB）。
2. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的ClearColi K12电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；
B. 对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。
C. 对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA，ddH2O溶解后电击转化。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入0.9ml预热的LB（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml离心管等），向离心管中补加LB培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。
6. 5000 rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 LB（务必使用高盐培养基平板，不可用 2YT，SOB，SOC 等低盐培养基）平板上。因菌量较大，若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个，将平板倒置 放于 37℃培养箱中培养 36-48 小时（培养 24 小时后可看到很小的克隆）
LB培养基（唯地CAT#：CM1010L）配方(PH:7.0):
Yeast Extract 5g
NaCl 10g
Tryptone 10g
注意事项
1. 因ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰，细胞易死亡，不易保存，平板菌在4度存放时间应不超过1周。且适合在高盐培养基中生长。
2. ClearColi K12电击感受态效率很低，不适用于构建质粒使用，一般用来扩繁质粒，提取高质量的无内毒素的质粒；若构建质粒，请选用DH5a、TOP10等转化效率较高的感受态细胞。
3. ClearColi K12菌株生长缓慢，平板在37度培养时间在36-48小时之间。
4. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
5. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
6. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
7. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
8. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
9. 对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
10. ClearColi K12菌株的细胞壁被修饰过，细胞比较脆弱，混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少用于涂板的菌量。
11. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。
