共表达分子伴侣表达感受态细胞
产品说明
本感受态套装由八种感受态组成：包括原始SHuffle T7 Express E. coli B，及七种分别转化一种伴侣蛋白组合的SHuffle T7 Express E. coli B制成的感受态细胞。E.coli 因其操作简单，经常用于表达各种异源蛋白，但在E.coli表达异源蛋白时容易产生包涵体；原核细胞在诱导剂诱导表达时转录和翻译速度较快，翻译出的蛋白来不及折叠成正确的构象，这种错误折叠容易产生暴露的疏水区，进而导致蛋白聚集产生包涵体。通过大量实验筛选出七种大小不同的分子伴侣组合，将这七种分子伴侣组合分别导入SHuffle T7 Express E. coli B，与目标蛋白共表达，可帮助目标蛋白形成正确的蛋白构象，增加产生可溶蛋白的比例。
SHuffle T7 Express E. coli B的染色体中整合了一个拷贝的二硫键异构酶 DsbC基因 ，可以促进含有二硫键蛋白的正确折叠；此外DsbC还是一个分子伴侣，可以帮助不含二硫键蛋白正确折叠，形成正确构象，同时该菌株缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，可减少对重组蛋白的降解。SHuffle T7 Express E. coli B菌株染色体中同时整合了一个拷贝的T7 RNA 聚合酶基因，可以表达噬菌体T7 RNA聚合酶，适合于T7启动子诱导的蛋白表达；该菌株还可以表达大肠杆菌RNA聚合酶，所以可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。SHuffle T7 Express E. coli B菌株具有抗T1 噬菌体感染的特点，具有链霉素，壮观霉素抗性。SHuffle T7 Express E. coli B感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒（2686bp，AmpR）检测转化效率>108 cfu/μg DNA。
产品规格
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产品名称 |
产品货号 |
说明书下载 |
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SHuffle T7 Express E. coli B 分子伴侣感受态套装 |
ECC3101 |
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产品内容
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组分名称 |
货号 |
规格 | 保存条件/时间 |
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SHuffle T7 Express E. coli B Competent Cell |
EC2031 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
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SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60 Competent Cell |
ECC3108 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE Competent Cell |
ECC3102 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES Competent Cell | ECC3103 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES Competent Cell | ECC3104 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-TIG Competent Cell | ECC3105 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES-TIG Competent Cell | ECC3106 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES-TIG Competent Cell | ECC3107 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| pUC19 (control vector, 10pg/μl) | —— |
10μl |
-80℃（36个月） |
| 分子伴侣诱导剂I（100×） | DR1103-5 |
5ml/支，2支 |
4℃（12个月） |
SHuffle T7 Express E. coli B 基因型
fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10 --TetS) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10
抗生素使用方法
本产品套装中SHuffle T7 Express E. coli B感受态不含有抗性质粒，转化原核表达质粒时，只需在培养基中加入原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选即可；SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60 感受态含有具有庆大霉素抗性的分子伴侣共表达质粒，转化原核表达质粒时，需同时在培养基中加入20μg/ml的庆大霉素和原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选和诱导；其余六种分子伴侣感受态均含有具有氯霉素抗性的分子伴侣共表达质粒，转化原核表达质粒时，需同时在培养基中加入20μg/ml的氯霉素和原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选和诱导。
抗生素使用浓度
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抗生素名称 |
配方 |
原液 |
工作液 |
|
羧苄青霉素 (carb) (唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
|
硫酸卡那霉素 (kan) (唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
|
氯霉素 (Cam) (唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素 (Gent) (唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
操作方法
1. 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
共表达分子伴侣，诱导目标蛋白操作步骤
一．SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60感受态诱导目标蛋白方法：
1. 筛选平板长出的菌落，接菌到大于20ml的透气试管（加入2ml 含相应抗生素的LB）中，37℃，200rpm小摇10-16h。
2. 小摇菌液变浓之后，按1-2%的比例接菌到大摇瓶中（20ml 以上含相应抗生素的LB；使用透气三角瓶；营养液的体积最好控制在三角瓶标定体积的10%-20%之间），37℃，200rpm摇菌直到菌液OD600=0.45-0.65时，加入终浓度1mM 的IPTG，继续培养。
3. 可37℃也可低温诱导（若低温诱导，需将菌液埋入冰中静置1-6min，充分降温到目标温度后再加入IPTG），也可在0.1-20mM范围内调整IPTG浓度。不同蛋白原核表达的最佳诱导温度，时间，诱导剂浓度需实验者优化。
附言：Cpn10、Cpn60分子伴侣在低温时活性更高，温度越高活性越低，最适温度为4-12度，其次12-25度。
二．其余6种分子伴侣感受态诱导目标蛋白方法：
1. 筛选平板长出的菌落，接菌到大于20ml透气试管（加入2ml 含相应抗生素的LB）中，37℃，200rpm小摇10-16h。
2. 小摇菌液变浓之后，按1-2%的比例接菌到大摇瓶中（20ml 以上含相应抗生素的LB；使用透气三角瓶；营养液的体积最好控制在三角瓶标定体积的10%-20%之间），同时在LB营养液中加入终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，37℃，200rpm摇
菌直到菌液OD600=0.45-0.65时，加入终浓度1mM 的IPTG，继续培养。
3. 可37℃也可低温诱导（若低温诱导，需将菌液埋入冰中静置1-6min，充分降温到目标温度后再加入IPTG），也可在0.1-20mM
范围内调整IPTG浓度。不同蛋白原核表达的最佳诱导温度，时间，诱导剂浓度需实验者优化。
附言：DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG分子伴侣来自大肠杆菌，在18-37度时活性更高，温度越高活性越高，最适温度为25-37度。
三．自诱导培养基诱导目标蛋白方法：
1. 小摇：参考以上菌株对应抗生素添加抗生素，37℃，200 rpm过夜摇菌约10-24h，菌体摇浓，一般要求OD600>2.0。
2. 按2-5%的比例接菌到AIM-2YT Broth自诱导培养基中，对BL21(DE3)-Cpn10-Cpn60，不需要添加分子伴侣诱导剂I；其余6种分子伴侣感受态，需添加终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，
A. 30-37度诱导：200-300rpm，摇菌8-24h。
B. 18-25度诱导：200-300rpm，摇菌12-48h。
C. 若所表达蛋白为毒性蛋白，可先在37度摇菌，待菌体OD600=0.8左右时降温到目标温度开始诱导蛋白表达。
3. 最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样。
分子伴侣的大小及检测
1. 本产品套装中共含有九种分子伴侣，分别为：DsbC：23.4kDa，Cpn10：10 kDa，Cpn60：60 kDa，DnaK：70 kDa左右，DnaJ：40 kDa左右，GrpE：20 kDa左右，EL：60 kDa左右，ES：10 kDa左右，TIG：60 kDa左右。
2. 这九种分子伴侣在SDS-PAGE凝胶电泳时，大部分情况可以看到共表达的分子伴侣条带，但10kDa，20 kDa并不清晰；若表达的目标蛋白影响了大肠杆菌的细胞周期，分子伴侣表达量会下降，可能看不到相应的分子伴侣条带。
不同菌株对应的分子伴侣
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菌株名称 |
共表达分子伴侣 |
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SHuffle T7 Express E. coli B |
DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60 |
DsbC，Cpn10，Cpn60 |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE |
DsbC，DnaK，DnaJ，GrpE，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES |
DsbC，EL，ES，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES |
DsbC，DnaK，DnaJ，GrpE，EL，ES，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-TIG |
DsbC，TIG，DsbC |
|
SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES-TIG |
DsbC，EL，ES，TIG，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES-TIG |
DsbC，DnaK，DnaJ，GrpE，EL，ES，TIG，DsbC |
相关产品货号
IPTG 溶液（1M，过滤除菌），货号：YC8022
LB 固体，货号：CM1010S
LB 液体，货号：CM1010L
高密度LB 液体培养基，货号：CM1310L
2YT 液体，货号：CM1016L
TB 液体，货号：CM1018L
AIM-LB 自诱导培养基，货号：AIM1014L
AIM-2YT 自诱导培养基，货号：AIM1016L
ZYM-5052液体，货号：AIM1031L
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可减少最终用于涂板的菌量。IPTG浓度可在0.1-20 mM之间优化，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需优化。
2. 分子伴侣诱导剂I（100×）在4℃可稳定保存12个月；放-20℃可稳定保存24个月。
产品规格
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产品名称 |
产品货号 |
说明书下载 |
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SHuffle T7 Express E. coli B 分子伴侣感受态套装 |
ECC3101 |
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产品内容
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组分名称 |
货号 |
规格 | 保存条件/时间 |
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SHuffle T7 Express E. coli B Competent Cell |
EC2031 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
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SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60 Competent Cell |
ECC3108 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE Competent Cell |
ECC3102 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES Competent Cell | ECC3103 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES Competent Cell | ECC3104 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-TIG Competent Cell | ECC3105 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES-TIG Competent Cell | ECC3106 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES-TIG Competent Cell | ECC3107 |
100μl /支，5支 |
-80℃（6个月） |
| pUC19 (control vector, 10pg/μl) | —— |
10μl |
-80℃（36个月） |
| 分子伴侣诱导剂I（100×） | DR1103-5 |
5ml/支，2支 |
4℃（12个月） |
SHuffle T7 Express E. coli B 基因型
fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10 --TetS) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10
抗生素使用方法
本产品套装中SHuffle T7 Express E. coli B感受态不含有抗性质粒，转化原核表达质粒时，只需在培养基中加入原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选即可；SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60 感受态含有具有庆大霉素抗性的分子伴侣共表达质粒，转化原核表达质粒时，需同时在培养基中加入20μg/ml的庆大霉素和原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选和诱导；其余六种分子伴侣感受态均含有具有氯霉素抗性的分子伴侣共表达质粒，转化原核表达质粒时，需同时在培养基中加入20μg/ml的氯霉素和原核表达质粒所带抗性抗生素进行筛选和诱导。
抗生素使用浓度
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抗生素名称 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素 (carb) (唯地CAT#：YC9040) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素 (kan) (唯地CAT#：YC9020) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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氯霉素 (Cam) (唯地CAT#：YC9030) |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素 (Gent) (唯地CAT#：YC9090) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
20 μg/ml |
操作方法
1. 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取50μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
共表达分子伴侣，诱导目标蛋白操作步骤
一．SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60感受态诱导目标蛋白方法：
1. 筛选平板长出的菌落，接菌到大于20ml的透气试管（加入2ml 含相应抗生素的LB）中，37℃，200rpm小摇10-16h。
2. 小摇菌液变浓之后，按1-2%的比例接菌到大摇瓶中（20ml 以上含相应抗生素的LB；使用透气三角瓶；营养液的体积最好控制在三角瓶标定体积的10%-20%之间），37℃，200rpm摇菌直到菌液OD600=0.45-0.65时，加入终浓度1mM 的IPTG，继续培养。
3. 可37℃也可低温诱导（若低温诱导，需将菌液埋入冰中静置1-6min，充分降温到目标温度后再加入IPTG），也可在0.1-20mM范围内调整IPTG浓度。不同蛋白原核表达的最佳诱导温度，时间，诱导剂浓度需实验者优化。
附言：Cpn10、Cpn60分子伴侣在低温时活性更高，温度越高活性越低，最适温度为4-12度，其次12-25度。
二．其余6种分子伴侣感受态诱导目标蛋白方法：
1. 筛选平板长出的菌落，接菌到大于20ml透气试管（加入2ml 含相应抗生素的LB）中，37℃，200rpm小摇10-16h。
2. 小摇菌液变浓之后，按1-2%的比例接菌到大摇瓶中（20ml 以上含相应抗生素的LB；使用透气三角瓶；营养液的体积最好控制在三角瓶标定体积的10%-20%之间），同时在LB营养液中加入终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，37℃，200rpm摇
菌直到菌液OD600=0.45-0.65时，加入终浓度1mM 的IPTG，继续培养。
3. 可37℃也可低温诱导（若低温诱导，需将菌液埋入冰中静置1-6min，充分降温到目标温度后再加入IPTG），也可在0.1-20mM
范围内调整IPTG浓度。不同蛋白原核表达的最佳诱导温度，时间，诱导剂浓度需实验者优化。
附言：DnaK、DnaJ、GrpE、EL、ES、TIG分子伴侣来自大肠杆菌，在18-37度时活性更高，温度越高活性越高，最适温度为25-37度。
三．自诱导培养基诱导目标蛋白方法：
1. 小摇：参考以上菌株对应抗生素添加抗生素，37℃，200 rpm过夜摇菌约10-24h，菌体摇浓，一般要求OD600>2.0。
2. 按2-5%的比例接菌到AIM-2YT Broth自诱导培养基中，对BL21(DE3)-Cpn10-Cpn60，不需要添加分子伴侣诱导剂I；其余6种分子伴侣感受态，需添加终浓度为1×的分子伴侣诱导剂I，
A. 30-37度诱导：200-300rpm，摇菌8-24h。
B. 18-25度诱导：200-300rpm，摇菌12-48h。
C. 若所表达蛋白为毒性蛋白，可先在37度摇菌，待菌体OD600=0.8左右时降温到目标温度开始诱导蛋白表达。
3. 最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，为找到最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样。
分子伴侣的大小及检测
1. 本产品套装中共含有九种分子伴侣，分别为：DsbC：23.4kDa，Cpn10：10 kDa，Cpn60：60 kDa，DnaK：70 kDa左右，DnaJ：40 kDa左右，GrpE：20 kDa左右，EL：60 kDa左右，ES：10 kDa左右，TIG：60 kDa左右。
2. 这九种分子伴侣在SDS-PAGE凝胶电泳时，大部分情况可以看到共表达的分子伴侣条带，但10kDa，20 kDa并不清晰；若表达的目标蛋白影响了大肠杆菌的细胞周期，分子伴侣表达量会下降，可能看不到相应的分子伴侣条带。
不同菌株对应的分子伴侣
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菌株名称 |
共表达分子伴侣 |
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SHuffle T7 Express E. coli B |
DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-Cpn10-Cpn60 |
DsbC，Cpn10，Cpn60 |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE |
DsbC，DnaK，DnaJ，GrpE，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES |
DsbC，EL，ES，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES |
DsbC，DnaK，DnaJ，GrpE，EL，ES，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-TIG |
DsbC，TIG，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-EL-ES-TIG |
DsbC，EL，ES，TIG，DsbC |
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SHuffle T7 Express E. coli B-KJE-EL-ES-TIG |
DsbC，DnaK，DnaJ，GrpE，EL，ES，TIG，DsbC |
相关产品货号
IPTG 溶液（1M，过滤除菌），货号：YC8022
LB 固体，货号：CM1010S
LB 液体，货号：CM1010L
高密度LB 液体培养基，货号：CM1310L
2YT 液体，货号：CM1016L
TB 液体，货号：CM1018L
AIM-LB 自诱导培养基，货号：AIM1014L
AIM-2YT 自诱导培养基，货号：AIM1016L
ZYM-5052液体，货号：AIM1031L
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率，混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可减少最终用于涂板的菌量。IPTG浓度可在0.1-20 mM之间优化，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需优化。
2. 分子伴侣诱导剂I（100×）在4℃可稳定保存12个月；放-20℃可稳定保存24个月。
