质粒图谱与基础信息

产品说明

1，本公司质粒均为质粒大提试剂盒提取质粒，因不同质粒的复制子不同，质粒浓度有差异，pRK2013质粒过大，拷贝数低，质粒浓度低，很难进行酶切和测序，如需鉴定可PCR扩增特定区域，对PCR产物进行测序鉴定。

2，随质粒同时提供一管含有质粒的DH5α-m甘油菌种，收到菌种后可直接放-80度长期保存，也可用交叉划线法划线后挑单菌落接菌，大量扩繁质粒。DH5α-m菌株兼顾DH5α和DH10B菌株的优点，在DH5α基因组中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突变使得DH5α-m菌株中保存的质粒更稳定，有利于质粒大量扩繁。

3，DH5α-m(含pRK2013质粒)甘油菌是用来扩繁质粒的，不用于三亲接合试验；在三亲本接合试验中，通常使用HB101(含pRK2013质粒)菌株（货号：Beh1011）

4，质粒序列可在产品页面下载snapgene文件或text文件。

pRK2013质粒来源及用途

pRK2013 是通过重组DNA技术构建的合成质粒，来源于 pRK2 质粒，pRK2 提供全套高效接合转移所需的基因（tra 和 trb 等）。为了使该质粒能在常规大肠杆菌中方便操作，研究人员将来源于 ColE1 质粒的复制起始位点（ColE1 ori）和一段包含卡那霉素抗性基因（kanR）的 Tn903 转座子插入到 pRK2 骨架中，保留了完整的 RK2 质粒接合转移基因，能有效驱动其他质粒的转移。自1980年构建以来，在超过 2000 篇文献中使用。其宿主范围广泛，能将质粒转移至不动杆菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属等多种革兰氏阴性菌，甚至部分革兰氏阳性菌中。

pRK2013工作原理：三亲本接合法 (Triparental Mating)

这是 pRK2013 最核心的应用场景。其工作原理涉及三种不同的细菌：

供体菌 (Donor)：含有待转移的目标质粒（该质粒需带有 oriT 转移起始点）的大肠杆菌。

辅助菌 (Helper)：含有 pRK2013 质粒的大肠杆菌。

受体菌 (Recipient)：最终接收目标质粒的目的菌，如根癌农杆菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等。

作用机制：将三种细菌混合培养时，pRK2013 利用其编码的接合蛋白（Mob/Tra 蛋白），游动进入供体菌。在供体菌内，pRK2013 识别目标质粒上的 oriT 序列，并动员目标质粒进入受体菌。pRK2013 本身通常不会进入最终受体菌，从而避免了外源遗传元件的持续干扰（部分实验中，pRK2013 可以进入受体菌，但不能在许多非肠道革兰氏阴性菌中复制）。

核心用途：非自转移质粒的动员 (Mobilization of Non-self-transmissible Plasmids)，作为最经典的帮助质粒（Helper Plasmid），pRK2013 的核心作用是辅助那些自身缺乏移动能力的质粒进行接合转移。在植物遗传转化、难转化芽孢杆菌或假单胞菌的质粒转化等实验中，它能通过三亲接合的方式，将目标质粒从大肠杆菌转移到根癌农杆菌、根瘤菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌等受体菌中。

附言：待转移的目标质粒必须带有一个特定的转移起始点（oriT），pRK2013 的游动和转移基因才能对其起作用，并驱动其转移进入受体菌；若质粒同时含有活化位点（bom），可促进质粒移动，部分受体菌不需要质粒含有bom序列。

菌株交叉划线法

1，客户收到菌株后，不可直接吸取菌液接种扩繁。应先对菌种进行复壮，待长出单菌落后挑单菌落接菌扩繁；复壮方法如下：在超净台打开盖子，用接种环沾取少量甘油菌液采用交叉划线法（图1）在含相应抗生素的LB平板表面轻轻划线(注意：不要刺破培养基)，将平板封口后放培养箱培养15-20h，即可长出单菌落。

2，交叉划线法：划线的目的是经过几次不连续划线达到梯度稀释菌液的效果，保证能长出单菌落。具体步骤如下：

A，-80度取出的甘油菌应在超净台打开盖子，立即在表面挑取菌液/菌块划线，不用等融化后划线，固体状态时即可用接种环挑取划线，操作要点是“快速操作，立即划线”，目的是最大限度减少温度波动对菌种造成的“冷休克”和冰晶物理损伤；如果收到的是液体甘油菌，可直接划线，在超净台打开盖子用接种环沾取少量甘油菌液划线。

B，用金属接种环灼烧待冷却后划线，注意不要污染，图1所示为标准的五段交叉划线法，分五个区，每个区划三条直线，第1、2区可共用一个接种环，划好1，2区后换一个新接种环划第3区，再换一个新接种环划第4区，再换一个新接种环划第5区，每一次换接种环划线要经过前面划线区的划线痕迹，这样就相当于对菌种进行稀释。简易划线也可只划3个区或4个区。

图1. 五段交叉划线法示意图

注意事项

1，收到含有质粒的菌株应立即放-80度，不可放-20度保存；在4度或室温长时间存放会增加发生错误突变的概率。

2，质粒在不同实验室保存的过程中有发生突变的概率，所以实际的测序结果与数据库下载序列可能会有部分序列存在SNP或突变，只要不在核心元件发生突变或不影响质粒核心功能，一般不影响使用。

相关文献

Hall, A., Donohue, T. J., & Peters, J. M. (2023). Complete sequences of conjugal helper plasmids pRK2013 and pEVS104. microPublication Biology, 2023. Available at: https://www.osti.gov/biblio/2202406.

Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., & Helinski, D. R. (1980). Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proceedings of the National Academy of Sciences, 77(12), 7347-7351.

Figurski, D. H., & Helinski, D. R. (1979). Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76(4), 1648-1652.