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SCK6 感受态细胞	Bsc1040S	10×100μl	pHT10 (control vector, 10ng/μl)  10μl×1支
			枯草孵育培养基BsLB  300μl×1支
	Bsc1040M	50×100μl	pHT10 (control vector, 10ng/μl)  10μl×1支
			枯草孵育培养基BsLB  1.5ml×1支

基因型

his, nprR2, nprE18, ΔaprA3, ΔeglS102, ΔbglT, bglS , lacA::PxylA-comK Ermᴿ

产品说明

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁不含脂多糖（LPS），表达的蛋白无需额外去除内毒素，适合医药或食品级应用；天然具有高效的分泌系统，可将目标蛋白直接分泌到培养基中，简化纯化步骤；多数情况下无包涵体问题，表达的可溶性蛋白正确折叠，尤其适合含二硫键的蛋白（胞外环境有助于氧化折叠）；培养简单，生长快，普通LB培养基、37℃振荡即可快速生长，发酵工艺成熟。SCK6菌株是1A751 的衍生菌株，是1A751 经 pAX01-comK 双交换整合获得的重组菌株，在 lacA 位点插入木糖诱导型 comK 表达盒（comK 为感受态主调控因子），可提高转化效率，常用于构建枯草芽孢杆菌文库。nprR2, nprE18：中性蛋白酶 NprE 相关基因缺陷；ΔaprA3：碱性蛋白酶基因aprA3缺失，进一步降低蛋白酶活性，适合外源蛋白表达；ΔeglS102, ΔbglT, bglS：敲除/失活了自身纤维素酶、β- 葡聚糖酶基因，本底酶活极低，适合做纤维素酶筛选实验。SCK6化转感受态细胞经特殊工艺制作，pHT10质粒（5826bp）检测转化效率>1×10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. SCK6感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，待感受态融化，加入目的质粒并用手拨打EP管底混匀。

2. EP管插入浮漂中，放37℃孵育1小时。

3. 每管加入20ul枯草孵育培养基BsLB，混匀后继续放37℃孵育1-2小时。

4. 拿出EP管，5000 rpm离心一分钟收菌，留取50 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB平板上。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养至少15小时。

抗生素使用浓度

大部分枯草芽孢杆菌表达质粒（pDG364、pHT43、pHT1469、pHT254【唯地货号：PB1011、PB1021、PB1031、PB1041】等）使用氯霉素进行筛选，SCK6使用的筛选浓度是5μg/ml(氯霉素溶液唯地货号：YC9030L)

LB液体培养基（货号: CM1010L）;LB 固体培养基（货号: CM1010S）。

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA，长时间存放会降低转化效率。

2. 加入枯草孵育培养基BsLB后，孵育2小时的转化效率相比孵育1小时可提高30%。

3. 枯草芽孢杆菌表达系统可用ITPG诱导型质粒或木糖诱导型质粒，当用IPTG诱导时，尽量使用不含乳糖的原料，若原料（蛋白胨，酵母粉等）中含有乳糖，会有严重的泄露表达（泄露表达是指不加诱导剂时目标蛋白的背景表达，大部分时候不影响试验）。

4. pHT10质粒为唯地生物优化后序列，去除一些非必须元件，添加额外的酶切位点，试验者可自行在MCS区添加各种适合枯草芽孢杆菌的蛋白表达框（组成型/诱导型），可同时添加2-3个独立的蛋白表达框同时表达2-3个蛋白。