筛选培养基（非常规碳源，氮源）
产品说明
YPRAA培养基是营养丰富的半合成培养基，不含葡萄糖，含有棉子糖作为碳源，是专门用于蔗糖转化酶(SUC2)缺陷型酿酒酵母YTK12菌株进行分泌信号功能验证的培养基。YTK12 酵母菌株为 SUC2基因缺陷型菌种，无法在以棉子糖为单一碳源的YPRAA 培养基上正常生长。只有将具有分泌活性的信号肽序列连接在 pSUC2 载体蔗糖酶基因SUC2的 N 端，转化入 YTK12 酵母菌株中，才能使蔗糖转化酶正常分泌，YTK12 酵母才能将棉子糖转化为葡萄糖，在 YPRAA 培养基上正常生长(Jacobs et al 1997，Oh et al 2009)。
产品规格
名称
货号
规格
目录价
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
YM8014S-01
2×0.5L/包
480
YM8014S-02
5×0.5L/包
1080
产品内容
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
抗霉素 A（Antimycin A）
包装名称
包装含量
包装数量
保存条件/时间
25g/袋 (可配0.5L YPRAA固体培养基)
2袋/5袋
室温干燥/24个月
20%棉子糖溶液（已过滤除菌）
100ml/250ml
室温干燥/12个月
1mg/ml 甲醇溶液（已过滤除菌）
200ul/ 500ul
-20度/ 12个月
产品组分与配方
酵母浸粉（Yeast Extract）
产品组分
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
蛋白胨（Peptone）
20g
10g
棉子糖（Raffinose）
20g
抗霉素 A（Antimycin A）
2ug/ml
Agar
20g
PH值( 25°C):7.0±0.1
培养基配制方法
YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)为固体培养基，取YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)一袋，加蒸馏水450ml搅拌溶解后，定容到0.5L(不用调ph值)，121℃-15min高压灭菌，灭菌后温度降到55度以下加入20%棉子糖溶液50ml，倒平板即为YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)平板；每100mlYPRA培养基中加入1mg/ml的抗霉素 A溶液200ul，倒平板即为YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)平板。
培养基使用方法
YTK12 酵母验证分泌信号肽功能的试验既可以用YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)培养基做，也可以用YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)培养基做
一，用YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)培养基验证分泌信号肽功能（pSUC2载体，唯地货号：PS1029；pSUC2-Avr1b载体，唯地货号：PS1028）：
1. 从CMD-W（唯地货号：YM8012S）或SD/-Trp（唯地货号：YM3103S）平板挑选含有目标质粒的单菌落在YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)培养基平板划线。
2. 平板培养48小时后，取新长出酵母菌落，转移到1.5ml无菌离心管中，加入1.5 mL无菌ddH2O洗涤三次。
3. 用750 μl无菌水重悬，加入250 μl TTC反应缓冲液，500 μl 10%蔗糖溶液（w/v），在37°C孵育10分钟。
4. 12 000 rpm离心1 min，取500 μl上清液，于1.5 mL离心管中，加入500 μl 1%TTC溶液，室温孵育20分钟。如果信号肽功能正常，会观察到溶液变红色，而携带pSUC2空载体的YTK12对照组不变色，或变色不明显(因没有加抗霉素A，此显色反应的时间需要控制，一般在1小时以内（通常20分钟）观察，时间过长，阴性对照也会变色)。
二，用YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)培养基验证分泌信号肽功能：
1. 从CMD-W或SD/-Trp平板挑选阳性单菌落接种到CMD-W液体培养基中振荡培养过夜。
2. 取1 mL菌液，5000 rmp离心1 min，弃上清，并用灭菌ddH2O洗涤三次，调OD600为0.5，用ddH2O进行梯度稀释10倍、100倍、1000倍（即OD600为0.05、0.005、0.0005）。
3. 按照顺序分别取5 μl点到CMD-W或SD/-Trp平板以及YPRAA平板上，30℃培养2-3 d，观察酵母菌落形态：若试验组的信号肽有功能，可在YPRAA平板上长出正常菌落；若无功能，在YPRAA平板上不长或生长势弱。
4. CMD-W液体培养基+2μg/mL的抗霉素A摇菌，取1.5 mL菌液，12 000 rpm离心1min，弃上清，加入1.5 mL无菌ddH2O洗涤三次。
5. 用750 μl无菌水重悬，加入250 μl TTC反应缓冲液，500 μl 10%蔗糖溶液（w/v），在37°C孵育10分钟。
6. 12 000 rpm离心1 min，取500 μl上清液，于1.5 mL离心管中，加入500 μl 1%TTC溶液，室温孵育20分钟。如果信号肽功能正常，会观察到溶液变红色，而携带pSUC2空载体的YTK12对照组不变色，或变色不明显。
关于抗霉素A（使用浓度：2μg/mL）
1. 功能：抑制酵母线粒体呼吸链，迫使酵母依赖发酵代谢（而非有氧呼吸）利用碳源；
2. 原理：抗霉素 A 通过结合线粒体复合体 III，阻断电子传递链，抑制有氧呼吸产生 ATP；此时酵母需通过发酵棉子糖（经蔗糖酶水解后）生成 ATP，间接 “强化” 蔗糖酶的分泌需求，确保检测信号（如 TTC 显色）更明显；
3. 若不加抗霉素A，酵母可通过有氧呼吸利用其他碳源（酵母粉中含有其他微量碳源）或胞内残留转化酶生长，产生假阳性，无法区分信号肽是否真的具备分泌功能。
注意事项
1. 若发现有严重吸潮现象，停止使用或酌情增加用量。若配制少于0.5L，按比例加入即可。
产品规格
名称
货号
规格
目录价
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
YM8014S-01
2×0.5L/包
480
YM8014S-02
5×0.5L/包
1080
产品内容
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
抗霉素 A（Antimycin A）
包装名称
包装含量
包装数量
保存条件/时间
25g/袋 (可配0.5L YPRAA固体培养基)
2袋/5袋
室温干燥/24个月
20%棉子糖溶液（已过滤除菌）
100ml/250ml
室温干燥/12个月
1mg/ml 甲醇溶液（已过滤除菌）
200ul/ 500ul
-20度/ 12个月
产品组分与配方
酵母浸粉（Yeast Extract）
产品组分
YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)
蛋白胨（Peptone）
20g
10g
棉子糖（Raffinose）
20g
抗霉素 A（Antimycin A）
2ug/ml
Agar
20g
PH值( 25°C):7.0±0.1
培养基配制方法
YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)为固体培养基，取YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)一袋，加蒸馏水450ml搅拌溶解后，定容到0.5L(不用调ph值)，121℃-15min高压灭菌，灭菌后温度降到55度以下加入20%棉子糖溶液50ml，倒平板即为YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)平板；每100mlYPRA培养基中加入1mg/ml的抗霉素 A溶液200ul，倒平板即为YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)平板。
培养基使用方法
YTK12 酵母验证分泌信号肽功能的试验既可以用YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)培养基做，也可以用YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)培养基做
一，用YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)培养基验证分泌信号肽功能（pSUC2载体，唯地货号：PS1029；pSUC2-Avr1b载体，唯地货号：PS1028）：
1. 从CMD-W（唯地货号：YM8012S）或SD/-Trp（唯地货号：YM3103S）平板挑选含有目标质粒的单菌落在YPRA(含琼脂粉，不含抗霉素A)培养基平板划线。
2. 平板培养48小时后，取新长出酵母菌落，转移到1.5ml无菌离心管中，加入1.5 mL无菌ddH2O洗涤三次。
3. 用750 μl无菌水重悬，加入250 μl TTC反应缓冲液，500 μl 10%蔗糖溶液（w/v），在37°C孵育10分钟。
4. 12 000 rpm离心1 min，取500 μl上清液，于1.5 mL离心管中，加入500 μl 1%TTC溶液，室温孵育20分钟。如果信号肽功能正常，会观察到溶液变红色，而携带pSUC2空载体的YTK12对照组不变色，或变色不明显(因没有加抗霉素A，此显色反应的时间需要控制，一般在1小时以内（通常20分钟）观察，时间过长，阴性对照也会变色)。
二，用YPRAA(含琼脂粉，含抗霉素A)培养基验证分泌信号肽功能：
1. 从CMD-W或SD/-Trp平板挑选阳性单菌落接种到CMD-W液体培养基中振荡培养过夜。
2. 取1 mL菌液，5000 rmp离心1 min，弃上清，并用灭菌ddH2O洗涤三次，调OD600为0.5，用ddH2O进行梯度稀释10倍、100倍、1000倍（即OD600为0.05、0.005、0.0005）。
3. 按照顺序分别取5 μl点到CMD-W或SD/-Trp平板以及YPRAA平板上，30℃培养2-3 d，观察酵母菌落形态：若试验组的信号肽有功能，可在YPRAA平板上长出正常菌落；若无功能，在YPRAA平板上不长或生长势弱。
4. CMD-W液体培养基+2μg/mL的抗霉素A摇菌，取1.5 mL菌液，12 000 rpm离心1min，弃上清，加入1.5 mL无菌ddH2O洗涤三次。
5. 用750 μl无菌水重悬，加入250 μl TTC反应缓冲液，500 μl 10%蔗糖溶液（w/v），在37°C孵育10分钟。
6. 12 000 rpm离心1 min，取500 μl上清液，于1.5 mL离心管中，加入500 μl 1%TTC溶液，室温孵育20分钟。如果信号肽功能正常，会观察到溶液变红色，而携带pSUC2空载体的YTK12对照组不变色，或变色不明显。
关于抗霉素A（使用浓度：2μg/mL）
1. 功能：抑制酵母线粒体呼吸链，迫使酵母依赖发酵代谢（而非有氧呼吸）利用碳源；
2. 原理：抗霉素 A 通过结合线粒体复合体 III，阻断电子传递链，抑制有氧呼吸产生 ATP；此时酵母需通过发酵棉子糖（经蔗糖酶水解后）生成 ATP，间接 “强化” 蔗糖酶的分泌需求，确保检测信号（如 TTC 显色）更明显；
3. 若不加抗霉素A，酵母可通过有氧呼吸利用其他碳源（酵母粉中含有其他微量碳源）或胞内残留转化酶生长，产生假阳性，无法区分信号肽是否真的具备分泌功能。
注意事项
1. 若发现有严重吸潮现象，停止使用或酌情增加用量。若配制少于0.5L，按比例加入即可。
