毕赤酵母感受态细胞
产品规格 （CAT#: PE1032）
PichiaPink 2 Elec-Competent Cell: 80μl/支 保存： -80℃（3个月）
1M 山梨醇溶液（0.45um过滤除菌） 10ml 保存：4℃（12个月）
pPink-LC (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转PichiaPink 2 感受态细胞 |
PE1032S |
10×80ul |
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| PE1032M | 50×80ul |
基因型
ade2, pep4
产品说明
PichiaPink 2菌株是由invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。PichiaPink 2是腺嘌呤缺陷型菌株，基因组中腺嘌呤合成途径相关基因2位点产生突变，自身无法合成腺嘌呤；部分携带ADE2筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPink-HC/pPink-LC/pPinkα-HC等）可以表达ADE2基因，与PichiaPink 2互补，通过腺嘌呤缺陷培养基(PD/PAD)来筛选整合成功的阳性转化子。ADE2 基因的编码产物为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶，该酶催化嘌呤核苷酸从头合成途径中的第六步反应 —— 将磷酸核糖氨基咪唑（AIR）羧化为磷酸核糖氨基咪唑羧酸（CAIR），是腺嘌呤和鸟嘌呤合成的必需步骤。若该基因发生突变，酵母会因嘌呤合成受阻，成为腺嘌呤营养缺陷型菌株，当 ade2 突变菌株处于腺嘌呤缺乏环境时，嘌呤合成前体物质（如磷酸核糖氨基咪唑）会在细胞内积累并转化为色素，使菌落呈现红色；转化了相关质粒的酵母可以提供有活性的ADE2蛋白，互补腺嘌呤缺陷表型，嘌呤合成正常，菌落为白色，所以可以根据菌落颜色判断质粒拷贝数，白色菌落为高拷贝，粉色菌落为中低拷贝。此外，PichiaPink 2菌株还突变了pep4(蛋白水解酶A)基因，能有效保护重组蛋白免受降解。针对具体的蛋白，很难预测是高拷贝的毕赤酵母菌落还是低拷贝毕赤酵母菌落作为宿主进行蛋白表达更好，虽然高拷贝酵母菌转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；虽然低拷贝的酵母菌转录得到的mRNA更少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质。PichiaPink 2电转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPink-LC质粒（7.7kb，AmpR in E.coli）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量1M山梨醇溶液（0.45μm过滤除菌）冰浴，每管感受态准备1ml。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的PichiaPink 2电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入2-10μg线性化的目的DNA (加入DNA的体积不超过8μl，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)，立即插入冰中。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预冷的1M山梨醇溶液，转移到30℃静置2-3小时。
6. 将感受态-DNA混合物转移到离心管中，4000 rpm离心30秒收菌，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。
筛选培养基选择
PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4010S
PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4020S
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。
2. pPink-LC质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SpeI/EcoN I/Afl II在TRP2 位点进行线性化。
3. 关于pPink系列毕赤酵母菌株筛选阳性菌落的筛选培养基：PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，筛选的酵母菌落生长偏慢；PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，菌落生长速度更快。
4. PichiaPink 2酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降，同时也不利于蛋白表达。
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产品名称 |
产品货号 |
产品规格 |
说明书下载 |
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电转PichiaPink 2 感受态细胞 |
PE1032S |
10×80ul |
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基因型
ade2, pep4
产品说明
PichiaPink 2菌株是由invitrogen公司开发专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。PichiaPink 2是腺嘌呤缺陷型菌株，基因组中腺嘌呤合成途径相关基因2位点产生突变，自身无法合成腺嘌呤；部分携带ADE2筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPink-HC/pPink-LC/pPinkα-HC等）可以表达ADE2基因，与PichiaPink 2互补，通过腺嘌呤缺陷培养基(PD/PAD)来筛选整合成功的阳性转化子。ADE2 基因的编码产物为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶，该酶催化嘌呤核苷酸从头合成途径中的第六步反应 —— 将磷酸核糖氨基咪唑（AIR）羧化为磷酸核糖氨基咪唑羧酸（CAIR），是腺嘌呤和鸟嘌呤合成的必需步骤。若该基因发生突变，酵母会因嘌呤合成受阻，成为腺嘌呤营养缺陷型菌株，当 ade2 突变菌株处于腺嘌呤缺乏环境时，嘌呤合成前体物质（如磷酸核糖氨基咪唑）会在细胞内积累并转化为色素，使菌落呈现红色；转化了相关质粒的酵母可以提供有活性的ADE2蛋白，互补腺嘌呤缺陷表型，嘌呤合成正常，菌落为白色，所以可以根据菌落颜色判断质粒拷贝数，白色菌落为高拷贝，粉色菌落为中低拷贝。此外，PichiaPink 2菌株还突变了pep4(蛋白水解酶A)基因，能有效保护重组蛋白免受降解。针对具体的蛋白，很难预测是高拷贝的毕赤酵母菌落还是低拷贝毕赤酵母菌落作为宿主进行蛋白表达更好，虽然高拷贝酵母菌转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；虽然低拷贝的酵母菌转录得到的mRNA更少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质。PichiaPink 2电转感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，线性化的pPink-LC质粒（7.7kb，AmpR in E.coli）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取适量1M山梨醇溶液（0.45μm过滤除菌）冰浴，每管感受态准备1ml。
2. 0.2 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
3. 取-80℃保存的PichiaPink 2电击感受态细胞插入冰中2-5分钟，待其融化，加入2-10μg线性化的目的DNA (加入DNA的体积不超过8μl，DNA纯度越高越好，保证尽可能低的离子含量)，立即插入冰中。
4. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物缓慢吹打两次，除去气泡，快速转移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动电击杯使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。
5. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=2kV，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，10秒内加入1ml预冷的1M山梨醇溶液，转移到30℃静置2-3小时。
6. 将感受态-DNA混合物转移到离心管中，4000 rpm离心30秒收菌，弃上清，留50ul上清重悬后涂布到含相应抗生素的筛选平板上，将平板倒置放于30℃培养箱培养3-5天。
筛选培养基选择
PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4010S
PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，可用于PichiaPink系列质粒的阳性菌落筛选；
唯地货号：PIM4020S
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，或使用更大的平板。
2. pPink-LC质粒要整合进毕赤酵母基因组中，在转化前必须做单酶切进行线性化，多用SpeI/EcoN I/Afl II在TRP2 位点进行线性化。
3. 关于pPink系列毕赤酵母菌株筛选阳性菌落的筛选培养基：PAD培养基:全合成腺嘌呤缺陷培养基，筛选的酵母菌落生长偏慢；PD培养基：半合成腺嘌呤缺陷培养基，菌落生长速度更快。
4. PichiaPink 2酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率下降，同时也不利于蛋白表达。
