今天是2020年2月27日 星期四,欢迎光临本站 上海唯地生物技术有限公司 网址: weidibio.com

农杆菌感受态_化转

EHA101

文字:[大][中][小] 2015-12-8    浏览次数:2477    

EHA101 Chemically Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: AC1040)

EHA101:                                                                  100μl/支
pK7WGF2(control vector,10ng/μl )                            10μl
保存条件(保质期):                                         -80℃(12个月) 

 

 基因型

C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline


 

产品说明

EHA101菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti质粒含有筛选标签:kan,赋予EHA101菌株和卡那霉素抗性,适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作。本公司生产的EHA101化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pK7WGF2质粒(壮观霉素抗性)检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

 

操作方法

1. -80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。

2.每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700 μl无抗生素的LBYEB液体培养基,于28℃,200 rpm振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LBYEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

(当平板只含有转化所用双元载体抗生素时,28℃培养48小时即可;平板中同时加入双元载体抗生素,20 μg/ml rif 时,需28℃培养60小时;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90小时)。

 

备注

1、农杆菌相关抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧苄青霉素(carb

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

链霉素(strep

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

庆大霉素(gent

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S


3LBYEB配方:

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Tryptone

10 g

10 g

Tryptone

5 g

5 g

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH 

PH7.0

PH7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g

 

 

 

NaOH 

PH7.0

PH7.0

 

 

 

Agar

15 g


注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

2. 混入质粒时应轻柔操作,转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml 壮观霉素,若所用平板同时含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失,但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)

说明书下载

EHA101 Chemically Competent Cell 产品说明书

返回上一步
打印此页
[向上]
在线客服

销售QQ

技术QQ

咨询电话:
021-34790199

请扫描二维码
打开手机站