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酵母感受态细胞

AH109

文字:[大][中][小] 2015-8-27    浏览次数:5800    

            AH109 Chemically Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: YC1010)

AH109 Competent Cell:                                      100μl/支              保存: -80℃(3个月)

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12个月

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存:-20℃(12个月

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12个月


基因型

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1 GAL2UAS- GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ



产品说明

AH109菌株来源于PJ69-2A 酵母菌株,将lacZ报告基因引入PJ69-2A诞生了AH109,此菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为:trp1leu2,报告基因为:lacZHIS3ADE2MEL1。AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒pGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和 prey发生相互作用,就会促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。AH109有四个报告基因:lacZHIS3ADE2MEL1,分别由三种不同的启动子 (GAL1,GAL2,MEL1)启动,这三种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。AH109感受态细胞经特殊工艺制作,-80可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

 
操作方法

1. 100 µl冰上融化的AH109感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µgCarrier DNA (95-1005 min,快速冰浴,重复一次) 10 µlPEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)

2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)

3. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。

4. ddH2O 50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h


注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. AH109酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48 h培养可见直径1 mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90 h培养可见直径1 mm克隆。


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