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表达感受态_热激

SHuffle T7 E. coli

文字:[大][中][小] 2019-3-1    浏览次数:1870    

SHuffle T7 E. coli Chemically Competent Cell 产品说明书




产品规格 (CAT#: EC2030)

SHuffle T7 E. coli:                                           100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                           10μl

保存条件(保质期):                                   -80℃(6个月) 


基因型

lac, pro, lacIq / Δ(ara-leu)7697 araD13fhuA2 lacZ::T7 gene1 Δ(phoA)Pvull phoR ahpC* galE(or U) galKλatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, laclq) ΔtrxBrpsL150(StrR)Δgor Δ(malF)3


产品说明


SHuffle T7 E. coli菌株是K12的衍生菌株。该菌株的染色体中整合了一个拷贝的二硫键异构酶 DsbC基因 ,可以促进含有二硫键蛋白的正确折叠;此外DsbC还是一个分子伴侣,可以帮助不含二硫键蛋白正确折叠,形成正确构象,同时该菌株可降低目的基因的本底表达,适合于毒性基因的原核表达。SHuffle T7 E. coli菌株染色体中整合了一个拷贝的T7 RNA 聚合酶基因,可以表达噬菌体T7 RNA聚合酶,适合于T7启动子诱导的蛋白表达;该菌株还可以表达大肠杆菌RNA聚合酶,所以可用于pET系列,pGEX,pMAL等质粒的蛋白表达。SHuffle T7 E. coli菌株具有抗T1 噬菌体感染的特点,具有链霉素,壮观霉素抗性。SHuffle T7 E. coli感受态细胞由特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率达108 cfu/μg DNA。



操作方法

1. SHuffle T7 E. coli感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的质粒并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700 μl不含抗生素的LB无菌培养液,37℃,200 rpm复苏60分钟。

4. 5000 rpm离心一分钟收菌,留取50 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。




Sample Induction Protocol (for reference only )

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 3ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃ overnight. 

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃ until the OD 600 reaches 0.5-0.8. (0.6 recommended; about 2.5h).

5. (Optional)Pipet 1ml of  the cultures into clean microcentrifuge tubes and  place the tubes on ice until  needed  for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-induced control samples.     

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃ for 2-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃ (storage at lower temperatures is also accep- table).  



IPTG配制:

     Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 

     by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use. 


注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 诱导时,IPTG浓度可选(0.1-10 mM均可)。

4. 为获得需要量的蛋白,最佳诱导时间,温度,IPTG浓度需实验者优化。

5. SHuffle T7 E. coli 菌株具有链霉素,壮观霉素抗性,不可用于具有链霉素,壮观霉素抗性质粒的转化。





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