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克隆感受态_快速转化

F-TOP10

文字:[大][中][小] 2016-4-17    浏览次数:2909    

F-TOP10快速转化感受态细胞产品说明书 




产品规格(CAT#: DF1010)

F-TOP10:                                                  100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                   10μl

保存条件(保质期):                            -80℃(6个月) 


基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nup



产品说明

TOP10菌株来源于MC1061,是目前实验室最常用的感受态细胞之一,基因型与DH10B高度类似 (DH10B为galE15型,而TOP10为galU型)。TOP10生长速度快,37℃,10小时可见克隆。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。可用于构建克隆,蓝白斑筛选等实验。


F-TOP10感受态细胞经特殊工艺制作,无需42℃热激,37℃孵育步骤,只需冰浴,10min内完成转化、涂板操作,pUC19质粒检测转化效率可达1~5×108 cfu/μg DNA。


快速转化操作方法 (10min)

1. 提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热

2. F-TOP10感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,,冰中静置5分钟。

3. 用200μl枪将感受态细胞-DNA混合物转移到已经37℃预热的2YT或LB培养基上。

4. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少13 h。


快速热激转化操作方法 

(25min,可提高转化效率)

1. F- TOP10感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,,冰中静置5分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟 (晃动会降低转化效率)。加入700 μl 不含抗生素的LB,37℃,200 rpm 复苏10分钟,涂板 (均匀,表面无水渍)。

3. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少15h。


注意事项

1. F-TOP10快速转化感受态细胞也可进行热激操作,对于>7 kb质粒的构建,为了提高转化效率可按以下步骤操作:F-TOP10感受态细胞从-80℃拿出,插入冰中,5分钟后,加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀,冰中静置20分钟。42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中静置2分钟。加入700 μl LB,37℃,200 rpm复苏30分钟,涂板。

2. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率,混入目的DNA时应轻柔操作。

3. F- TOP10快速转化感受态细胞涂氨苄/羧苄青霉素抗性平板时效率较高,若涂卡那霉素或其他抗生素平板,转化效率下降(因无孵育步骤,卡那霉素等对菌体毒性较大)。若要提高卡那霉素或其他抗性质粒的转化效率,可按热激转化操作,增加孵育步骤。

说明书下载

F-TOP10快速转化感受态细胞产品说明书


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