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克隆感受态_快速转化

F-DH5α

文字:[大][中][小] 2016-4-17    浏览次数:4999    

F-DH5α快速转化感受态细胞产品说明书




产品规格 (CAT#: DF1001)

F-DH5α:                                                   100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                   10μl

保存条件(保质期):                            -80℃(6个月)



基因型

F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 pho


产品说明

DH5α菌株是实验室最常用的感受态细胞。 缺失核酸内切酶 (endA),提高了质粒DNA的产量和质量;重组酶缺陷型 (recA)减少插入片段的同源重组概率,保证了插入DNA 的稳定性;lacZΔM15的存在使DH5α可用于蓝、白斑筛选。


F-DH5α感受态细胞经特殊工艺制作,无需42℃热激,37℃孵育步骤,只需冰浴,10min内完成转化、涂板操作,pUC19质粒检测转化效率可达1~5×10 8cfu/μg DNA。


 快速转化操作方法 (10min)

1. 提前15分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

2. F-DH5α感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,,冰中静置5分钟。

3. 用200 μl枪将感受态细胞-DNA混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上,涂均匀,表面无水渍。

4. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少15h。


 快速热激转化操作方法 (25min,可提高转化效率)

1. F-DH5α感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,,冰中静置5分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟 (晃动会降低转化效率)。加入700 μl 不含抗生素的LB,37℃,200 rpm 复苏10分钟,涂板 (均匀,表面无水渍)。

3. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少15h。



注意事项

1. F-DH5α快速转化感受态细胞也可进行热激操作,对于>7 kb质粒的构建,为了提高转化效率可按以下步骤操作:F-DH5α感受态细胞从-80℃拿出,插入冰中,5分钟后,加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀,冰中静置20分钟。42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中静置2分钟。加入700 μl LB,37℃,200 rpm复苏30分钟,涂板。

2. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率,混入目的DNA时应轻柔操作。

3. F-DH5α快速转化感受态细胞涂氨苄/羧苄青霉素抗性平板时效率较高,若涂卡那霉素或其他抗生素平板,转化效率下降(因无孵育步骤,卡那霉素等对菌体毒性较大)。若要提高卡那霉素或其他抗性质粒的转化效率,可按热激转化操作,增加孵育步骤。

说明书下载

F-DH5α快速转化感受态细胞产品说明书


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