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克隆感受态_热激

DH10Bac

文字:[大][中][小] 2016-3-31    浏览次数:5278    

DH10Bac Chemically Competent Cell 产品说明书

 



产品规格(CAT#: DL1071)

DH10Bac:                                                100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                   10μl

保存条件(保质期):                            -80℃(6个月) 



基因型

F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124


产品说明

DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272 、辅助质粒 pMON7124 :父本杆粒 bMON14272包含 mini-F复制子, 卡那抗性基因, attTn7 位点和 lacZα互补因子;辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区(tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid),具有四环素抗性,在细胞扩增过程中丢失,但可提高供体质粒pFastBac(具有庆大霉素抗性)转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(Therefore , genomic DNA , both  prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac)。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选,DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg DNA。


操作方法

供体质粒(pFastBac等)转化重组方法:

 

1. DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入供体质粒(pFastBac等)1ng,并用手拨打EP管底混匀,冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基,37℃,225 rpm复苏4小时。

4. 复苏完成后,用SOC稀释转化液到(10-1,10-2),每个稀释用吸取100ul铺一个LB平板(共涂3个平板),平板包含50ug/ml Kan,7ug/ml Gentamicin,7ug/ml tetracycline,40ug/ml X-gal,40ug/ml IPTG。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱48h(抗生素含量较高,需在37度长时间培养才能挑到合适克隆)。


  阳性验证:

 

  1. 挑10个白色的克隆,重新划线在LB平板(50ug/ml Kan,7ug/ml Gentamicin,7ug/ml tetracycline,40ug/ml X-gal,40ug/ml IPTG)。37度过夜培养。

2. 挑选白色的克隆,转接到含有50ug/ml Kan,7ug/ml Gentamicin,7ug/ml tetracycline的LB培养液中,过夜培养。

3. 使用试剂盒(QIAGEN cat. 12162)或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA(>100kb)。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。



pUC19检测转化效率方法:


1. DH10Bac感受细胞态从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底混匀,冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB,37℃,200 rpm复苏60分钟。

4. 取100μl转化液涂布到含50-100ug/ml氨苄的LB平板上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱12-16h,统计计算转化效率。


注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化,插入冰中8分钟内加入目标DNA,不可在冰中放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 涂板时务必涂干,平板表面不留任何水份。






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